Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В НЕЙРОНАУКАХ

2019-11-08T16:30:35+03:00

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ В ИЗУЧЕНИИ СТРОЕНИЯ ИОННЫХ КАНАЛОВ И ИХ МОДУЛЯЦИИ ЛИГАНДАМИ

2019-11-08T16:30:35+03:00

Ионные каналы представляют собой разнообразное семейство трансмембранных белков, которые регулируют поток ионов через клеточные мембраны. Они вовлечены в многочисленные физиологические процессы и являются мишенями для разнообразных природных токсинов и фармакологических препаратов. Однако молекулярные детали структур каналов, механизмы их работы и взаимодействия с лигандами все еще обсуждаются. Одной из причин этого является нехватка трехмерных структур атомарного разрешения. В течение последних двух десятилетий значительный вклад в эту область внесли косвенные экспериментальные подходы, включая мутагенез, электрофизиологию и анализ структурно-функциональных связей в рядах лигандов. Молекулярное моделирование широко применялось для структурной интерпретации этих экспериментальных данных. Последние достижения рентгеновской кристаллографии и криоэлектронной микроскопии дают однозначные решения многих структурных проблем, которые ранее решались только косвенными и модельными исследованиями. В этом обзоре описывается несколько примеров структурных предсказаний, которые были сделаны с помощью молекулярного моделирования с целью объяснения косвенных экспериментальных данных. Мы сравниваем модели с недавно опубликованными экспериментальными структурами. Хорошее согласие многих предсказаний с более поздними опубликованными экспериментальными структурами подтверждает перспективы дальнейшего использования молекулярных модельных исследований. Имеющиеся в настоящее время и ожидаемые структуры основных ионных каналов и их комплексов с лигандами обеспечивают реалистичные шаблоны для моделирования каналов, их множественных вариантов, в том числе связанных с каналопатиями, и для предсказания связывания фармакологических препаратов и токсинов. Эти исследования, как ожидается, обеспечат высококачественные прогнозы, которые необходимы для разработки новых специфичных для канала лигандов и рекомендаций по персонализированной терапии.

НОВЫЕ ПОДХОДЫ В ИССЛЕДОВАНИИ МОЛЕКУЛЯРНОГО ПАТОГЕНЕЗА СПИНОЦЕРЕБЕЛЛЯРНОЙ АТАКСИИ 2-ГО ТИПА

2019-11-08T16:30:37+03:00

Спиноцеребеллярная атаксия 2-го типа (СЦА2) представляет собой прогрессирующее наследственное заболевание, причиной которого на генетическом уровне является экспансия полиглутамина в белке атаксин-2. Эффективные способы терапевтического лечения, так же как и болезнь-модифицирующая терапия всё ещё недоступны для пациентов с СЦА2. На настоящий момент пациентам предписывают только симптоматическое лечение вместе с методами паллиативной медицины. С целью поиска новых терапевтических мишеней для лечения заболевания СЦА2 многими научными группами были предприняты попытки исследовать физиологические, молекулярные и биохимические изменения нейронов мозжечка в случае пациентов, больных СЦА2, а также на различных модельных системах. Современные подходы в исследовании патогенеза СЦА2 позволили получить новые сведения о молекулярных механизмах заболевания и предложить возможные стратегии для потенциальной терапии данной болезни. В настоящей работе обобщены актуальные сведения о генетической основе СЦА2, описаны известные на настоящий момент свойства и функции белка атаксин-2, рассмотрены механизмы дегенерации клеток коры мозжечка, нарушения их физиологических функций, а также связанные с ними повреждения проводящих путей мозжечка, представлены сведения о современных модельных системах, позволяющих изучать основы СЦА2, а также приведена информация о новых подходах в исследовании молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии СЦА2, таких как агрегация, окислительный стресс, нарушения клеточной сигнализации и кальциевого сигналинга, рассмотрена роль аутофагии и микроглии в молекулярном патогенезе СЦА2.

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ФАРМАКОЛОГИИ: ФОКУС НА РЕЦЕПТОРАХ СЛЕДОВЫХ АМИНОВ

2019-11-08T16:30:38+03:00

Открытые двадцать лет назад рецепторы следовых аминов (Trace Amine-Associated Receptors; TAARs) позволили наметить новые пути лечения психоневрологических расстройств. Важным оказался тот факт, что через сравнительно короткий промежуток времени после открытия рецепторов была создана линия трансгенных животных с нокаутом гена рецептора TAAR1. Данные, полученные с помощью нокаутных животных, дали возможность понимания не только функции рецепторов, но и механизмов действия психотропных веществ, взаимодействий нейротрансмиттеров со следовыми аминами, механизмов патологии, в которых следовые амины играют не последнюю роль. В этом кратком обзоре будут рассмотрены функции рецепторов следовых аминов и роль трансгенных животных в их изучении.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИЙ МОЗГА ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫМИ ИНСТРУМЕНТАМИ

2019-11-08T16:30:39+03:00

Методы, базирующиеся на генетически кодируемых молекулярных конструкциях, такие как антисенс-нокдаун и РНК-интерференция, изменяющие экспрессию целевых генов, широко используются для анализа функции кодируемых этими генами белков, а также находят применение в медицинской практике. С помощью этих методов, например, было установлено, что даже кратковременное снижение экспрессии одного из рецепторов норадреналина в критический период развития мозга оставляет длительный след на нейрохимическом и поведенческом уровнях в последующей жизни. Доставка в клетки мозга вирусных конструкций, кодирующих какие-либо белки, влияющие на функции клетки, или малые шпилечные РНК (shRNA), снижающие экспрессию целевого гена, также находит применение в нейробиологии. Ярким проявлением мощи генетически кодируемых инструментов в исследованиях центральной нервной системы, инструментов, потенциально пригодных для управления активностью клеток мозга с терапевтическими целями, являются оптогенетика и хемогенетика. Оба подхода реализуются путем экспрессии в желаемом типе клеток новых для организма рецепторов, реагирующих на свет определенной длины волны или несвойственную для организма химическую молекулу лиганда. Эти подходы позволяют оценить функциональные последствия изменения активности специфической популяции нейронов, что обеспечило, например, существенный прогресс в расшифровке механизмов центральной регуляции поведения. Так, с помощью оптогенетики обнаружено, что активация глутаматергических нейронов дорзального гиппокампа индуцирует депрессивно-подобное поведение, а антидепрессантный эффект кетамина на это поведение осуществляется прямым действием препарата на NMDA- рецепторы. Разработанные в последние несколько лет методы редактирования генома и управления экспрессией генов на основе бактериальных CRISPR/Cas систем уже используются для изучения функции мозга. В настоящее время на модельных объектах с оптимистическими ожиданиями разрабатываются возможные способы применения опто- и хемогенетики, а также CRISPR/Cas технологий в медицине.

НЕЙРОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМОВ ХРАНЕНИЯ ПАМЯТИ

2019-11-08T16:30:40+03:00

Статья посвящена анализу возможных подходов к исследованию механизмов хранения памяти на уровне долговременных перестроек уровня экспрессии генов, специфически вовлеченных в формирование и хранение памяти. В настоящее время известно всего несколько генов кандидатов хранения памяти. Разработки последних двух-трех лет с использованием генетических конструкций, направленно меняющих работу некоторых генов, демонстрируют возможность управлять работой нервной сети в физиологических и патологических условиях. Комплексные локус-специфические перестройки хроматина в регуляторных областях генов пластичности в ответ на различные внешние стимулы (обучение), в конечном итоге, могут предопределять длительные изменения экспрессии этих генов и, возможно, представляют собой один из путей регуляции материальных субстратов памяти. Тонкая модуляция работы генома при формировании памяти достигается, в том числе, посредством локус-специфических изменений эпигенома (посттрансляционные модификации гистонов и метилирование ДНК). Дальнейшая разработка подходов для селективной эпигенетической регуляции работы некоторых генов пластичности (редактирование эпигенома) может представлять большой интерес для исследования физиологических функций в нервной системе и коррекции поведенческих реакций, памяти и различных патологических состояний.

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ОПТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ИССЛЕДОВАНИЮ ФУНКЦИЙ МОЗГА И ПРОТЕЗИРОВАНИЮ ДЕГЕНЕРАТИВНОЙ СЕТЧАТКИ

2019-11-08T16:30:41+03:00

Оптогенетика, которую можно определить как метод, позволяющий осуществлять управление при помощи света активностью нейронов за счет экспрессии в них светоактивируемых белков, является мощным инструментом в нейрофизиологических исследованиях. Оптогенетика определила значительный прогресс в изучении функций мозга в последнюю декаду. Прогресс оптогенетики решающим образом зависит от разработки новых молекулярных инструментов – светоактивируемых белков.

Для возбуждения клеток в оптогенетике наиболее часто используется природный светоактивируемый катионный канальный родопсин2 (ChR2). В 2015 г. был идентифицирован природный светоактивируемый хлорный канал GtACR2, способный в оптогенетических экспериментах с высокой эффективностью подавлять активность нейронов. Мы обнаружили уникальные свойства данного канала, показав, что в GtACR2-экспрессирующих нейронах световой стимул, помимо сильного торможения, также может вызывать генерацию потенциалов действия, которая происходит, по всей видимости, в аксонных терминалях нейрона за счет измененного потенциала реверсии хлора в этих отделах клетки.

В своей работе мы применяем оптогенетичекие методы для изучения клеточных механизмов обучения и памяти. Используя экспрессию канального родопсина2 в сети пресинаптических нейронов, мы применяли в рамках одного эксперимента световую стимуляцию для изучения свойств синаптических связей и их пластичности в целой популяции нейронов.

Одним из перспективных направлений клинического применения оптогенетики является ее использование для протезирования дегенеративной сетчатки. Вариантом такого подхода является воссоздание ON/OFF рецептивного поля ганглиозных клеток сетчатки путем таргетированной экспрессии возбуждающего светоактивируемого белка в центральной части ганглиозной клетки, а тормозного – в периферической. В рамках данного подхода нами была создана бицистронная конструкция, несущая гены возбуждающего и тормозного опсинов, экспрессия которой была способна привести к восстановлению ON/OFF взаимодействий, характерных для ганглиозного нейрона.

ЗЕБРАДАНИО (ZEBRAFISH) КАК НОВАЯ ПЕРСПЕКТИВНАЯ МОДЕЛЬ В ТРАНСЛЯЦИОННОЙ НЕЙРОБИОЛОГИИ

2019-11-08T16:30:44+03:00

Danio Rerio (zebrafish, зебраданио) – относительно новый модельный объект, все более активно используемый в различных биомедицинских исследованиях, включая изучение центральной нервной системы (ЦНС) и поиск новых лекарственных средств. Количество исследований, посвященных нейробиологии зебраданио, стремительно растет и в относительном размере превосходит рост публикаций по всем другим модельным организмам в биомедицине. Популярность модели обеспечили относительная простота ее использования, хорошо описанная физиология, высокая генетическая гомология с людьми, быстрое развитие, и низкая цена исследований. В работе обсуждается текущая роль зебраданио в трансляционной нейробиологии и потенциал их использования с новейшими методиками биологических исследований. Несмотря на то, что поиск и описание эффектов известных психоактивных веществ на зебраданио активно внедряется в повседневную практику, в том числе и в России, исследование заболеваний на данной модели остается ограниченным. Мы подчеркиваем важность исследований патогенеза ЦНС на зебраданио в связи с высоким потенциалом модели как объекта, эволюционная консервативность и относительная простота лабораторного применения которого может помочь определить основные биомаркеры гетерогенных заболеваний.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТТЕРНОВ КАЛЬЦИЕВОЙ ДИНАМИКИ В СЕТЯХ АСТРОЦИТОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА

2019-11-08T16:30:45+03:00

Астроциты кодируют информацию о состоянии окружающей нервной ткани в виде пространственно-временных паттернов Ca²⁺ активности. В свою очередь, Ca²⁺ события в астроцитах через ряд механизмов влияют на синаптическую пластичность, высвобождение глиопередатчиков и локальный кровоток. Использование генетически кодируемых Ca²⁺ индикаторов позволило визуализировать астроцитарную Ca²⁺ активность на уровнях от тонких периферических отростков до целых клеточных доменов и сетей клеток. Интерпретация экспериментальных результатов требует использования адекватных методов обработки данных, включая стабилизацию изображений, подавление шума, разделение сигнала на быстрые и медленные компоненты, сегментацию отдельных событий сигнализации и установление возможных закономерностей в появлении этих событий. В данной работе демонстрируется, что спонтанная Ca²⁺ активность в отдельных астроцитах имеет вид локализованных событий. Эти события возникают преимущественно на периферии пространственных доменов астроцита и характеризуются распределениями с тяжелым хвостом по размерам и длительностям. Локальные кинетические параметры нарастания и затухания флуоресценции привязаны к морфологии клетки; в зависимости от степени вовлеченности крупных отростков в наблюдаемые события, присутствуют градации средней амплитуды и пиковой скорости изменения флуоресценции. На уровне астроцитарной сети наблюдаются флуктуации суммарной Ca²⁺ активности, наибольший вклад в пики активности вносят одиночные события, охватывающие целиком пространственный домен астроцита. Разработанные методические подходы и полученные данные могут пролить свет на принципы формирования пространственно-временных паттернов астроцитарной Ca²⁺ активности и их вовлеченность в когнитивные процессы.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕПТИДНЫХ ЛИГАНДОВ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ MEKTX13-2 И MEKTX13-3 ИЗ ЯДА СКОРПИОНА MESOBUTHUS EUPEUS

2019-11-08T16:30:47+03:00

Токсины скорпионов, блокирующие калиевые каналы, в настоящее время служат незаменимыми молекулярными инструментами исследований в нейробиологии. При этом наблюдается острая нехватка соединений, селективно воздействующих на определенные изоформы каналов. Ранее из яда Среднеазиатского скорпиона Mesobuthus eupeus мы выделили целый ряд токсинов, воздействующих на потенциал-чувствительные калиевые каналы. Далее мы изучили активность двух сходных токсинов M. eupeus, получивших названия MeKTx13-2 и MeKTx13-3, на панели калиевых каналов и обнаружили, что они характеризуются селективным действием в отношении изоформы K_v1.1, экспрессия которой характерна для центральной нервной системы млекопитающих. Мы полагаем, что эти результаты позволят получить производные токсинов с повышенной селективностью к K_v1.1, которые будут востребованы в исследованиях нервной системы.