ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ РЕФЕРЕНСНЫХ ГЕНОВ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ ПРОВЕДЕНИИ АНТИОКСИДАНТНОЙ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ В ЛИТИЙ-ПИЛОКАРПИНОВОЙ МОДЕЛИ ВИСОЧНОЙ ЭПИЛЕПСИИ
PDF

Ключевые слова

ОТ-ПЦР
референсный ген
экспрессия генов
мРНК
височная эпилепсия
литий-пилокарпиновая модель
мозг

Как цитировать

Шварц, А. П., Дёмина, А. В., Захарова, М. В., Коваленко, А. А., Грязнова, М. О., Ищенко, А. М., & Зайцев, А. В. (2022). ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ РЕФЕРЕНСНЫХ ГЕНОВ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ ПРОВЕДЕНИИ АНТИОКСИДАНТНОЙ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ В ЛИТИЙ-ПИЛОКАРПИНОВОЙ МОДЕЛИ ВИСОЧНОЙ ЭПИЛЕПСИИ. Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова, 108(6), 781–792. https://doi.org/10.31857/S0869813922060073

Аннотация

Обратная транскрипция в сочетании с количественной (в реальном времени) полимеразной цепной реакцией (ОТ-кПЦР) является золотым стандартом для оценки экспрессии генов на уровне РНК, однако требует тщательного выбора валидных референсных генов для нормализации результатов. Целью данной работы было определение оптимальных референсных генов для ОТ-кПЦР экспериментов в височной коре и дорзальном гиппокампе мозга крыс в латентную фазу (период эпилептогенеза до появления спонтанных рецидивирующих судорог) литий-пилокарпиновой модели височной эпилепсии на фоне раздельного или сочетанного применения рекомбинантного провоспалительного цитокина – рецепторного антагониста интерлейкина-1 (100 мг/кг в сутки) и комбинации антиоксидантов (100 мг/кг витамина С, 200 мг/кг витамина Е, 25 мкг/кг S-аденозилметионина). Была проанализирована экспрессия 9 референсных генов (Actb, B2m, Gapdh, Rpl13a, Sdha, Ppia,Hprt1, Pgk1, Ywhaz). С помощью сервиса RefFinder® мы определили оптимальные референсные гены для оценки уровня содержания целевых мРНК в дорзальном гиппокампе (Gapdh, Pgk1, Hprt1) и височной коре (Pgk1, Sdha, Ppia) головного мозга. При этом было выявлено значимое усиление экспрессии генов Actb и B2m в дорзальном гиппокампе, которое не подавлялось ни применением IL-1ra, ни смесью антиоксидантов, ни их сочетанием. Мы также оценили уровень экспрессии гена провоспалительного цитокина интерлейкина-1 бета (Il1b) в дорзальном гиппокампе, нормируя его относительно трёх оптимальных (Gapdh, Pgk1, Hprt1) референсных генов либо относительно нестабильных Actb и B2m. В случае использования оптимальных референсных генов было обнаружено, что экспрессия гена Il1b увеличивается в латентную фазу литий-пилокарпиновой модели эпилепсии, и ни один из видов терапии не изменяет этой реакции. При нормировке относительно уровня мРНК Actb и B2m, изменения экспрессии гена Il1b в дорзальном гиппокампе в латентную фазу литий-пилокарпиновой модели не выявляются. Исходя из этого, гены Actb и B2m могут быть вовлечены в процесс эпилептогенеза и не могут использоваться в качестве референсных в эпилептических моделях. Таким образом, результаты нашей работы демонстрируют важность аккуратного выбора референсных генов.

https://doi.org/10.31857/S0869813922060073
PDF

Литература

Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT (2009) The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 55:611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J (2010) How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods 50:227–230. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.11.001

Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002) Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3: RESEARCH0034. https://doi.org/10.1186/gb-2002-3-7-research0034

Silver N, Best S, Jiang J, Thein SL (2006) Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC Mol Biol 7:33. https://doi.org/10.1186/1471-2199-7-33

Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP (2004) Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper – Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett 26:509–515.

Zhou J, Zhang X, Ren J, Wang P, Zhang J, Wei Z, Tian Y (2016) Validation of reference genes for quantitative real-time PCR in valproic acid rat models of autism. Mol Biol Rep 43:837–847. https://doi.org/10.1007/s11033-016-4015-x

Schwarz AP, Kovalenko AA, Malygina DA, Postnikova TY, Zubareva OE, Zaitsev AV (2020) Reference Gene Validation in the Brain Regions of Young Rats after Pentylenetetrazole-Induced Seizures. Biomedicines 8:239. https://doi.org/10.3390/biomedicines8080239

Löscher W (2017) Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res 42:1873–1888. https://doi.org/10.1007/s11064-017-2222-z

Terrone G, Balosso S, Pauletti A, Ravizza T, Vezzani A (2020) Inflammation and reactive oxygen species as disease modifiers in epilepsy. Neuropharmacology 167:107742. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2019.107742

Dyomina AV., Kovalenko AA, Zakharova MV, Postnikova TY, Griflyuk AV, Smolensky IV, Antonova IV, Zaitsev AV (2022) MTEP, a Selective mGluR5 Antagonist, Had a Neuroprotective Effect but Did Not Prevent the Development of Spontaneous Recurrent Seizures and Behavioral Comorbidities in the Rat Lithium-Pilocarpine Model of Epilepsy. Int J Mol Sci 23:497. https://doi.org/10.3390/ijms23010497

Racine RJ (1972) Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 32:281–294. https://doi.org/10.1016/0013-4694(72)90177-0

Ming Z, Fan Y, Yang X, Lautt WW (2006) Synergistic protection by S-adenosylmethionine with vitamins C and E on liver injury induced by thioacetamide in rats. Free Radic Biol Med 40:617–624. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2005.09.034

Dyomina AV, Zubareva OE, Smolensky IV, Vasilev DS, Zakharova MV, Kovalenko AA, Schwarz AP, Ischenko AM, Zaitsev AV (2020) Anakinra Reduces Epileptogenesis, Provides Neuroprotection, and Attenuates Behavioral Impairments in Rats in the Lithium-Pilocarpine Model of Epilepsy. Pharmaceuticals (Basel) 13:340. https://doi.org/10.3390/ph13110340

Schwarz AP, Malygina DA, Kovalenko AA, Trofimov AN, Zaitsev AV (2020) Multiplex qPCR assay for assessment of reference gene expression stability in rat tissues/samples. Mol Cell Probes 53:101611. https://doi.org/10.1016/j.mcp.2020.101611

Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF (2004) Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res 64:5245–5250. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-04-0496

Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods 25:402–408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262

Lin W, Burks CA, Hansen DR, Kinnamon SC, Gilbertson TA (2004) Taste receptor cells express pH-sensitive leak K+ channels. J Neurophysiol 92:2909–2919. https://doi.org/10.1152/jn.01198.2003

Malkin SL, Amakhin DV., Veniaminova EA, Kim KK, Zubareva OE, Magazanik LG, Zaitsev AV (2016) Changes of ampa receptor properties in the neocortex and hippocampus following pilocarpine-induced status epilepticus in rats. Neuroscience 327:146–155. https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2016.04.024

Yamaguchi M, Yamauchi A, Nishimura M, Ueda N, Naito S (2005) Soybean Oil Fat Emulsion Prevents Cytochrome P450 mRNA Down-Regulation Induced by Fat-Free Overdose Total Parenteral Nutrition in Infant Rats. Biol Pharm Bull 28:143–147. https://doi.org/10.1248/bpb.28.143

Bonefeld BE, Elfving B, Wegener G (2008) Reference genes for normalization: A study of rat brain tissue. Synapse 62:302–309. https://doi.org/10.1002/syn.20496

Langnaese K, John R, Schweizer H, Ebmeyer U, Keilhoff G (2008) Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in a rat asphyxial cardiac arrest model. BMC Mol Biol 9:53. https://doi.org/10.1186/1471-2199-9-53

Swijsen A, Nelissen K, Janssen D, Rigo J-M, Hoogland G (2012) Validation of reference genes for quantitative real-time PCR studies in the dentate gyrus after experimental febrile seizures. BMC Res Notes 5:685. https://doi.org/10.1186/1756-0500-5-685

Kyzar EJ, Zhang H, Sakharkar AJ, Pandey SC (2017) Adolescent alcohol exposure alters lysine demethylase 1 (LSD1) expression and histone methylation in the amygdala during adulthood. Addict Biol 22:1191–1204. https://doi.org/10.1111/adb.12404

Pohjanvirta R, Niittynen M, Lindén J, Boutros PC, Moffat ID, Okey AB (2006) Evaluation of various housekeeping genes for their applicability for normalization of mRNA expression in dioxin-treated rats. Chem Biol Interact 160:134–149. https://doi.org/10.1016/j.cbi.2006.01.001

Rioja I, Bush KA, Buckton JB, Dickson MC, Life PF (2004) Joint cytokine quantification in two rodent arthritis models: kinetics of expression, correlation of mRNA and protein levels and response to prednisolone treatment. Clin Exp Immunol 137:65–73. https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2004.02499.x

Paxinos G, Watson C (2005) The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates - The New Coronal Set, 5th ed. Elsevier Acad Press. San Diego, CA.

Sadangi C, Rosenow F, Norwood BA (2017) Validation of reference genes for quantitative gene expression analysis in experimental epilepsy. J Neurosci Res 95:2357–2366. https://doi.org/10.1002/jnr.24089

Marques TEBS, de Mendonça LR, Pereira MG, de Andrade TG, Garcia-Cairasco N, Paçó-Larson ML, Gitaí DLG (2013) Validation of Suitable Reference Genes for Expression Studies in Different Pilocarpine-Induced Models of Mesial Temporal Lobe Epilepsy. PLoS One 8:e71892. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071892

Schwarz AP, Kovalenko AA, Malygina DA, Postnikova TY, Zubareva OE, Zaitsev AV (2020) Reference Gene Validation in the Brain Regions of Young Rats after Pentylenetetrazole-Induced Seizures. Biomedicines 8:239. https://doi.org/10.3390/biomedicines8080239

Chapman JR, Waldenström J (2015) With Reference to Reference Genes: A Systematic Review of Endogenous Controls in Gene Expression Studies. PLoS One 10:e0141853. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141853

Schwarz AP, Kovalenko AA, Malygina DA, Postnikova TY, Zubareva OE, Zaitsev AV (2020) Reference Gene Validation in the Brain Regions of Young Rats after Pentylenetetrazole-Induced Seizures. Biomedicines 8:239. https://doi.org/10.3390/biomedicines8080239